《食品科学》：广东海洋大学魏帅副教授等：超声联合高压CO2处理对虾原肌球蛋白结构和致敏性的影响

  ）营养物质丰富、味道鲜美，具有适应能力强、生长速度快、养殖成本低等优点，已成为全世界养殖最广泛的甲壳类水产品。食物过敏是指过敏患者接触到特定食物后所反映出来的过敏性不良反应，主要症状为鼻炎、荨麻疹、腹泻等，严重时可导致过敏性休克甚至危及到生命。研究表明，80%的虾过敏都是由原肌球蛋白（TM）引起，其具有热稳定性，高温处理难以改变其结构，因此水产品在经过常规烹制后仍可能具备极高的致敏性。

  超声（US）是一种新型非热加工技术，可通过空化作用产生机械剪切和湍流效应，同时形成局部瞬时高压改变蛋白的空间结构，以此来降低蛋白致敏性，但对食物风味及营养的东西破坏较小。高压CO2（HPCD）是指在压强低于50 MPa、温度不高于60 ℃的条件下，使CO 2 达到超临界状态的一种新型食品非热加工方式。在HPCD处理过程中，CO 2 在高压条件下溶于溶液使体系形成高压酸性环境，在高压、pH值和CO 2 分子效应共同作用下实现杀菌、钝酶和蛋白质变性等目的，且HPCD处理条件温和（温度较低、隔绝氧气），对食品的风味和质构特性影响较小。单一加工方式降低致敏性效果有限，通过两种或多种加工方式联合可更有效降低过敏原致敏性。

  广东海洋大学食品科技学院的杨玉莹、李言初、魏帅*等研究以凡纳滨对虾TM为对象，采用不一样参数条件的USHPCD处理凡纳滨对虾TM，探究其对TM致敏性和构象的影响，旨在为开发新型低敏食品提供新技术途径。

  采用US、HPCD、US-HPCD 3 种加工方式处理TM，iELISA结果如图1所示。与对照组相比，3 种加工方式均能明显降低TM IgG/IgE免疫结合活性（

  P＜0.05），其中US-HPCD消减致敏性效果最佳，显著优于单独US和HPCD处理（P＜0.05）。

  采用不同US功率（0～2 000 W）处理TM 15 min，再采用HPCD处理，结果如图2所示。功率为0 W即HPCD单独处理，此时IgE和IgG的OD450 nm分别为0.84、1.19，与未处理组相比其IgE和IgG免疫结合活性分别降低8.9%、17.9%。这原因是在HPCD处理下，TM暴露在表面的致敏表位被破坏，导致致敏性下降。但是当US功率为500 W时，包埋在TM内部的致敏表位被暴露出来，此时TM致敏性反而增强；继续增加US功率至1 500 W，与对照组相比，IgG和IgE的免疫结合活性分别降低28.7%、20.8%，可能是在US-HPCD的作用下部分致敏表位被掩埋；US功率增加到2 000 W时，TM IgE结合能力非常明显升高，IgG结合能力无明显变化，说明TM结构重新达到一种稳定状态。根据结果得出，联合处理过程中US功率的改变对TM致敏性有显著影响，其中功率为500 W时，TM致敏性最强，1 500 W时致敏性最弱。

  采用1 500 W功率US处理TM 0、5、15、30、60 min，再采用HPCD处理，结果如图2所示。随着US时间的延长，IgE和IgG免疫结合活性都呈现先升高再降低的趋势。US处理30 min，再进行HPCD处理后，与对照组相比，IgE和IgG的免疫结合活性分别消减了48.7%、55.3%；在US处理时间为60 min时，与对照组相比，TM IgE和IgG的免疫结合活性分别消减了48.6%、58.8%，与US处理30 min组相比，IgE结合能力无显著变化，IgG结合能力降低。联合处理过程中US时间延长降低了TM致敏性，综合考虑时间因素，选用US处理30 min。综上，US-HPCD联合加工最佳工艺条件确定为US 1 500 W处理30 min，继续HPCD 30 MPa处理15 min。

  Zhang Ziye等采用US处理TM，发现有蛋白降解，以此来降低了TM致敏性。Pang Lidong等采用US处理乳清蛋白，发现其空间结构的改变可能是造成致敏性降低的根本原因。Qiu Hui等采用HPCD处理小清蛋白，可降低致敏性39%～41%。Zhong Hangyu等研究之后发现US辅助低温等离子处理对虾TM会使蛋白结构发生剧烈变化，因此导致IgE和IgG结合能力分别下降52.4%和46.5%。

  采用兔抗虾TM多克隆抗体分析US-HPCD不同条件处理后TM的IgG结合能力，免疫印迹结果如图3所示。采用不一样US功率（0～2 000 W）处理TM 15 min，再采用HPCD处理，与对照组相比，处理后的TM条带灰度明显减少。US功率1 500 W时，TM出现降解（图3A）。采用1 500 W功率US处理TM 0、5、15、30、60 min，再采用HPCD处理，US处理时间5 min时，TM主条带降解产生了小片段；US处理30 min时，TM的IgG免疫结合活性明显减弱（图3B），这与iELISA测定结果相印证。

  SDS-PAGE是评估蛋白质分子质量分布的常用手段，TM经US-HPCD不同条件处理后，采用SDS-PAGE分析TM分子质量的变动情况。如图4所示，随着US功率的增加和时间的延长，约在12、14、17 kDa处出现极浅的降解条带。US功率1 500 W处理30 min时，主条带宽度最窄，说明在加工的过程中蛋白发生聚沉形成难溶沉淀，降解条带灰度随之加深，说明US-HPCD可使TM发生降解。王新研究之后发现单独使用HPCD处理TM会使条带灰度变浅，但不可能会产生新条带。Han Tinglu等发现随着US时间的延长，TM条带强度明显减弱。US-HPCD会改变TM分子质量，这原因是US的机械振动和空化效应以及HPCD所产生的CO2分子效应使TM的肽链断裂或重组，从而使蛋白分子质量发生明显的变化。因此，进一步对US-HPCD处理后TM的二、三级结构可以进行测定分析，探究US-HPCD对TM结构的影响。

  利用圆二色光谱对TM的二级结构可以进行检测，由图5A1可知，未处理的TM在190 nm波长左右出现正峰，在222 nm和209 nm波长处出现双负峰，说明TM为典型的α-螺旋结构。经过不同条件US-HPCD处理后，TM的圆二色光谱发生改变，使用CDNN软件对数据来进行分析，发现处理后TM的二级结构含量发生显著变化（

  -螺旋含量先降低后升高，-折叠、-转角和无规卷曲含量先增高后降低。当US功率为1 500 W时，-螺旋相对含量最低，由83.3%降低至56.8%，-折叠相对含量由1.9%增高至10.0%，-转角相对含量由9.2%增高至17.6%，无规卷曲相对含量由5.7%增高至15.7%。经US功率1 500 W处理0～60 min，再采用HPCD处理，随着US处理时间的延长，TM的-螺旋含量降低，-折叠和-转角含量升高，无规卷曲含量先升高后降低；当US处理时间为30 min时，-螺旋相对含量为42.7%，-折叠、-转角和无规卷曲相对含量分别为14.9%、18.1%和24.3%，与US处理60 min组相比无明显变化，但与未处理组相比存在非常明显差异（图5B2）。根据结果得出，在US-HPCD处理过程中，US功率和时间都能改变TM的二级结构，导致-螺旋含量降低，无规卷曲、-折叠和 β -转角含量呈现不同程度的增加，使TM由有序状态向无序状态转化，分子内部疏水基团暴露，TM变得松散。US-HPCD处理使TM二级结构发生变化可能是由US的空化作用和HPCD的CO2效应共同作用所致。

  -螺旋向-折叠和-转角转变，与本研究结果不同，原因是其研究对象是虾全蛋白，虾TM的优势构象是-螺旋，而虾全蛋白的优势构象是-折叠，因此二级结构变化趋势不同。Zhang Ziye等发现US处理可以使TM-螺旋含量明显降低，无规卷曲、-折叠和-转角含量明显地增加。Qiu Hui等发现HPCD处理会使-螺旋含量降低，无规卷曲、-折叠和-转角含量呈现不同程度的增加，且致敏性会降低。Cheng Junhu等发现随着等离子体处理时间延长，-螺旋含量下降，而-折叠和无规卷曲的含量分别上升，致敏性下降。以上研究与本研究所得结论一致，-螺旋结构与TM致敏性相关，随着-螺旋含量的下降，TM致敏性也下降。

  内源性荧光（天然荧光）是指蛋白质中的芳香族氨基酸如色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸受到280 nm或295 nm波长的激发光会产生荧光，此荧光特性对微环境的改变很敏感，当微环境发生明显的变化时，荧光强度会随即改变，从而反映出蛋白质的构象和三级结构变化。如图6A所示，未处理组TM在332 nm波长处有最大吸收峰，在USHPCD处理过程中，随着US功率的增加，荧光强度均呈现下降趋势，说明在高强度的US处理过程中，TM的结构逐渐展开。US功率为1 500 W时，荧光强度最小，与未处理组相比下降了49.8%，且最大吸收波长发生蓝移。US功率1 500 W处理0～60 min，再采用HPCD处理，随着US处理时间的延长，荧光强度呈现先下降后升高的趋势，表明TM结构经历了由折叠到伸展，再由伸展到折叠的动态变化。在US时间为30 min时（图6B），与未处理组相比下降了51.4%，且最大吸收波长发生蓝移（332 nm到310 nm）。综上，说明US-HPCD处理改变了TM的三级结构。

  -乳清蛋白，接着来进行糖基化反应，降低了其荧光强度，说明US产生的物理化学作用会促进蛋白的三级结构发生变化。郭明慧等发现高密度CO 2 可以诱导凡纳滨对虾肌球蛋白疏水基团暴露，使蛋白三级结构松散。Ekezie等发现随着冷氩等离子体处理时间的延长，埋藏在蛋白内部的疏水基团部分暴露，导致疏水性增强。Wang Fengqi等发现低温等离子体协同糖基化处理虾TM使荧光强度逐步降低，说明协同处理使TM三级结构破坏更彻底。

  紫外光谱可表征小分子和蛋白质之间的相互作用，可用于研究溶液状态下蛋白质的空间构象。紫外吸收光谱主要由侧链上的色氨酸、酪氨酸，以及组氨酸、苯丙氨酸和半胱氨酸侧链基团决定，蛋白暴露的芳香族氨基酸越多，紫外吸收强度越强。如图7所示，未处理组TM在265 nm波长左右有紫外特征吸收峰，说明它主要由其肽链上酪氨酸残基的芳杂环π→π*跃迁引起。在US-HPCD处理过程中（图7A），随着US功率的增加，紫外吸收峰强度逐渐增强，在US功率为1 500 W时紫外吸收峰强度最大。经US功率1 500 W处理0～60 min，再采用HPCD处理，随着US处理时间的延长，紫外吸收峰强度也呈现增强的趋势，紫外吸收峰出现轻微的红移（261 nm到264 nm）（图7B）。特征吸收峰轻微红移表明US-HPCD加工方法改变了TM所处的微环境，而紫外吸收峰强度增大可能是TM空间结构展开或重聚，掩藏在蛋白内部的芳香族氨基酸暴露所导致。

  刘爱成等发现，经过US处理，乳清蛋白紫外吸收光谱未发生偏移，紫外吸收峰强度增强。Qiu Hui等发现随着HPCD处理条件的改变，紫外特征吸收峰未出现，紫外吸收峰强度增加。以上研究表明单独使用US或者HPCD对蛋白来加工可能不会改变蛋白所处的微环境，但US-HPCD联合对蛋白来加工，在US的剪切和空化作用及HPCD的CO2效应和pH值共同作用下，TM的微环境有几率发生极性变化，同时肽键可能也受到破坏，与SDSPAGE结果相印证。

  邻苯二甲醛可以与游离氨基反应生成黄色络合物，在340 nm波长处有特征吸收峰，可用以表征蛋白结构的展开程度。如图8A所示，在US-HPCD处理过程中，随着US功率的增加，游离氨基含量整体呈现减少的趋势。在US功率为1 500 W时，与对照组相比游离氨基含量降低了12.08%；经US功率1 500 W处理0～60 min，再采用HPCD处理，随着US处理时间的延长，游离氨基含量呈现先减少后趋于平缓的趋势（图8B），在30 min时，与对照组相比游离氨基含量降低了21.82%，继续延长时间游离氨基含量并无显著变化（

  P＜0.05）。综上，USHPCD处理可使TM空间构象发生改变，当处理条件为US在1 500 W处理30 min联合HPCD 30 MPa处理15 min时，蛋白结构展开程度最大，致敏性降低最多，与上述iELISA、蛋白印迹结果及二、三级结构变化规律相印证。

  总巯基包括暴露在蛋白质表面的游离巯基和掩藏在蛋白质内部的巯基。在功能基团中，巯基尤为活跃，能够反映蛋白聚集和展开过程中的交联状态，在结构组成中占了重要位置。如图9所示，与未处理组相比，US-HPCD不同处理条件下均可以使总巯基含量显著下降（P＜0.05）。随着US功率的增加，TM总巯基含量呈现先下降后上升的趋势，当US功率为1 500 W时，总巯基含量最低。经US功率1 500 W处理0～60 min，再采用HPCD处理，随着US处理时间的延长，TM总巯基含量呈现下降趋势，在处理时间为30 min后，继续延长时间对总巯基含量无显著影响（

  P＜0.05）。在US-HPCD处理TM过程中，US处理会使水分子形成瞬态自由基，随后交叉反应生成过氧化氢，暴露的游离巯基会被过氧化氢不可逆地氧化为磺酸或亚磺酸，使总巯基含量下降。HPCD处理TM过程中，TM受到压力和 CO 2 共同作用，空间结构进一步展开，埋藏在蛋白质内部的巯基暴露，暴露的巯基被氧化形成二硫键，导致巯基含量减少。综上，USHPCD处理可使TM的总巯基含量减少，当1 500 W US处理30 min联合HPCD处理时，巯基含量减少最显著，继续延长时间巯基含量无显著变化，致敏性降低最多，这与前期二级结构变化规律结果相印证。

  本研究探究不同参数条件下US-HPCD对凡纳滨对虾TM致敏性和空间构象的影响。根据结果得出，US-HPCD（US 1 500 W，30 min；HPCD 30 MPa，15 min）可使TM IgG和IgE的免疫结合活性分别降低55.3%、48.7%。在此联合处理下，TM二级结构由有序变为无序，

  -螺旋相对含量降低至42.7%，-折叠、-转角和无规卷曲含量显著增高；荧光光谱发生蓝移，荧光强度减弱，紫外吸收峰发生红移，紫外吸收强度增强；游离氨基和总巯基含量均降低。US-HPCD作为非热加工方法之一，能大大降低TM致敏性，为开发低致敏性水产品提供了新途径。